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新型长循环脂质体的研制实验

更新时间:2023-04-07浏览:881次

长循环纳米脂质体作为难溶性药物载体,因具有体内长循环、靶向、保护、高效低毒等特性,极大地解决了脂质体作为纳米给药载体的不足而倍受青睐,是很有发展前景的药物载体。

长循环纳米脂质体又被称立体稳定脂质体,它是在普通脂质体的基础上加入一定比例的衍生物,使表面暴露出一些亲水性的多糖或多羟基基团等,从而减少了与血浆中的成分结合,增加了脂质体在血液中的稳定性,从而延长了药物在血液中的作用时间,使药物有更充足的时间到达靶向部位,增强药物的治疗效果。现在常用的长循环纳米脂质体的修饰物有:神经节苷脂GM1、聚乙二醇(PEG)、非离子表面活性剂及其类脂衍生物等。其中PEG及其类脂衍生物因具有无免疫毒性且来源广泛等优点,目前已经成为医学上常用的长循环脂质体表面修饰物,其主要包括PEG-DSPCPEG-PEPEG-DSPEPEG-PC等。被修饰后的脂质体可因PEG分子中大量的亲水基团与水结合构成空间位阻,降低吞噬细胞的破坏与吞噬的几率,延长有效成分在血液中的滞留时间,使其血药浓度较长时间的作用于靶器官中,使药物的治疗效果明显提高。长循环纳米脂质体存在以下优点:因脂质体的粒径为纳米级别,注射长循环纳米脂质体后被包裹的药物更易透过细胞膜,采用PEG对脂质体进行表面修饰,使脂质体具备长循环和立体稳定结构的特点,对减少肝脏巨噬细胞对药物的吞噬,维持平稳的血药浓度,提高药物靶向性和生物利用度、延长药物在体内循环时间等具有重要作用和意义。

为了使长循环脂质体制剂更好的应用于工业生产和临床,国内外学者对脂质体制备工艺的进行了深入的研究,研制出了多种的新型长循环脂质体,包括长循环磁性脂质体、长循环热敏脂质体、长循环阳离子脂质体、长循环免疫脂质体等。新型长循环脂质体的研制将为复方长循环脂质体的进一步开发提供新的思路与方向。

 

实验设备:

Agilent-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);

CP2250分析天平(奥豪斯国际贸易有限公司);

RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)

SHB-Ⅲ真空泵(郑州长城科工贸有限公司);

WST-NANO

高速冷冻离心机(德国Heraeus公司);

5200H超声波清洗器(上海科岛超声仪器有限公司);

DF-101B集热式恒温磁力搅拌器(浙江省乐清县乐成电器厂)

 

实验步骤与结果:

1三种长循环脂质体制备方法:

为了获得粒径较小的纳米级的脂质体,本实验选取了的三种常用制备脂质体的方法并且联合微射流均质技术进行比较,分别为薄膜分散-微射流均质法、乙醇注入-微射流均质法和逆相蒸发法-微射流均质法,采用3种不同的方法制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体,通过比较制得的长循环纳米脂质体的包封率及粒径大小对其进行评价。

1.1 薄膜分散-微射流均质法

精密称取蟾酥提纯物5.20mg,成膜材料大豆卵磷脂和胆固醇分别为40mg10mgDSPE-mPEG20002mg,溶解于100mL氯仿中,置于减压旋转蒸发仪上旋蒸(45℃100r/min)直至氯仿蒸干。然后加入50mLPBS缓冲液(pH6.8)于圆底烧瓶中进行洗膜,经恒温水化10min,进行超声30min,采用genizer微射流均质机对所制备的蟾酥提取物长循环脂质体混悬液进行均质,过0.22μm微孔滤膜整粒,即为蟾酥提取物长循环纳米脂质体溶液。

1.2 乙醇注入-微射流均质法

精密称取蟾酥提纯物物5.20mg,成膜材料大豆卵磷脂和胆固醇分别为40mg10mgDSPE-mPEG20002mg,溶于100mL乙醇作为有机相,pH6.8PBS缓冲液作为水相,在1200r·min1的搅拌转速下,将有机相匀速缓慢滴入50℃保温水相中,继续搅拌2h,挥去乙醇,超声30min,用genizer微射流均质机对所得混悬液进行均质,过0.22μm微孔滤膜整粒,即得蟾酥提取物长循环纳米脂质体混悬液。

1.3 逆向蒸发-微射流均质法

精密称取蟾酥提纯物5.20mg加入到50mLpH7.0PBS缓冲液,作为水相,精密称取成膜材料大豆卵磷脂和胆固醇分别为40mg10mgDSPE-mPEG20002mg,加入50mL氯仿使其溶解。将水相加入到有机相中,超声处理5min,得W/O乳剂,置减压旋转蒸发器上于恒温45℃水浴中减压旋转蒸发除去氯仿,得稠厚的胶状物,于干燥箱中室温条件下放置4h,加入50mLpH6.8PBS缓冲溶液,洗膜,进行超声30min,采用genizer微射流均质机对所制备的长循环脂质体混悬液进行均质,过0.22μm微孔滤膜整粒,即得蟾酥提取物长循环纳米脂质体混悬液。

 

结果

1. 长循环脂质体外观

 

采用超速离心法测定制备的蟾酥提取物长循环纳米脂质体得包封率,14000r/min离心30min,分离游离药物和含药脂质体,测定其包封率和粒径。通过比较所测得的包封率和粒径大小来选取制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体方法,具体结果见下表1

 

制备方法对长循环纳米脂质体包封率和粒径的影响

从上表中可以看出,由于均采用与微射流均质法联合应用,三种制备方法所制得的蟾酥长循环纳米脂质体的粒径差别并不明显,而测得的包封率有较大的差别,采用薄膜分散法制备的长循环纳米脂质体的包封率最大,其次是乙醇注入法,而逆向蒸发法最小。三种方法均结合微射流均质法测得的粒径最小的为薄膜分散法,综合包封率和粒径2个评价指标,最终最终选择薄膜分散微射流均质法制备蟾酥长循环纳米脂质体

 

长循环脂质体制备工艺单因素考察

本实验采用薄膜分散微射流均质法制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体,以包封率为主要评价指标,以形态外观为参考,选取有机溶剂的种类、磷脂与胆固醇的比例、药脂比、DSPE-mPEG2000的用量、水化温度、超声时间、微射流压力作为单因素考察。在单因素试验的基础上,选取影响较大的因素作为主要因素,采用星点设计效应面法对蟾酥提取物长循环纳米脂质体的工艺进行优化。本

其中:微射流均质压力对包封率的影响

固定制备条件:卵磷脂:蟾酥提取物(7:1);卵磷脂:胆固醇(3:1);超声时间40min;水化温度65℃;加入50mL的氯仿有机溶剂;磷酸盐缓冲液PH=6.8;加入5%DSPE-mPEG2000;减压旋蒸温度43℃。变化条件:微射流压力,分别为60MPa80MPa100MPa120MPa140MPa

方法:采用薄膜分散法制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体,结合微射流均质法减小其粒径,测定其包封率,具体结果见下表2

不同微射流压力对包封率的影响

实验结果表明,微射流仪压力对包封率也存在着影响,当压力超过100MPa时,脂质体包封率减小,原因可能是过大的压力导致脂质体破坏,破乳所致,因此本实验选择微射流仪压力为100MPa

 

其他单因素检测细节:略

 

星点设计优化蟾酥提取物长循环纳米脂质体处方与工艺单因素试验结果表明,超声时间(X1)、卵磷脂:蟾酥提取物(X2)、卵磷脂:胆固醇(X3)对蟾酥长循环纳米脂质体的包封率有较大影响。因此在单因素实验考察的基础上,根据星点设计-效应面原理,将较为显著的3个因素作为自变量,z高水平设定为:X150minX29:1X34:1,z低水平设定为:X130minX25:1X32:1,以包封率(Y)为因变量,优化蟾酥长循环纳米脂质体的处方与工艺。

Box-Behnken试验结果分析应用DesignExpert8.0软件对表3-11工艺优化试验因素水平的试验结果进行二次多元回归拟合,得二次多项回归模型方程Y=86.160.33A—1.18B+1.60C0.42AB+0.55AC+1.38BC1.50A22.09B21.50C2R2=0.9518。模型的R21较接近,说明通过二次回归得到的模型与试验拟合较好。同时,响应面二次回归方程方差分析结果显示:模型F=15.37P0.05),不显著,因此二次模型成立。

影响脂质体包封率的主要因素分析包封率模型(Y)回归方程的方差分析表明BCBCA2B2C2项达极显著水平(P<0.01),交互项ABACP分别为0.31890.2022,均大于0.05,所以交互项ABAC对颗粒的一次成型率没有显著性影响。通过F值大小可以判断,选取的3个主要因素对包封率影响大小依次为,磷脂:胆固醇(X3>磷脂:蟾酥提取物(X2>超声时间(X1

 

优化处方验证蟾酥长循环纳米脂质体的最佳制备工艺为:

精密称取蟾酥提取物20mg,大豆卵磷脂140mg,胆固醇40mgDSPE-mPEG20009mg,溶于100mL氯仿中,于旋转蒸发仪上减压旋蒸(43℃100r/min),有机溶剂氯仿全部除去的同时,烧瓶内壁上会形成一层白色薄膜。此时加入50mLPBS缓冲液(pH6.8)洗膜,再依次经60℃恒温搅拌水化20min,超声40min,设定genizer微射流均质机压力为100MPa,对所得混悬液进行均质,混悬液于14000r/min离心1h,分离游离药物和含药脂质体,测定其包封率。根据最佳制备工艺制备三批蟾酥提取物长循环纳米脂质体,分别测定华蟾酥毒基与脂蟾毒配基总含量的包封率。具体结果见表3

 

工艺验证结果

讨论与小结

脂质体制备方法有多种,实验中选用薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸发法结合微射流均质法制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体,以包封率和粒径作为考察指标,选取理想的制备方法。

实验结果表明,选取的三种制备方法对粒径结果影响较小,而对包封率的影响较为明显。采用薄膜分散法制备的长循环纳米脂质体包封率最高,其次是乙醇注入法,z低的是逆向蒸发法,因为此法对水溶性药物包封率较高,而蟾酥中的华蟾毒配基和脂蟾毒配基于脂溶性成分,因此逆向蒸发法制得的蟾酥提取物长循环纳米脂质体的包封率低。且考虑到薄膜分散法工艺简单,测定包封率较高,因此选用薄膜分散法制备脂质体,但仅使用薄膜分散法制得的长循环纳米脂质体粒径过大,若结合微射流均质法能使脂质体的粒径减小,有利于均匀分散。因此,最终选择薄膜分散微射流均质法制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体。

本实验首先进行单因素考察蟾酥提取物长循环纳米脂质体的处方与工艺,对有机溶剂种类的选择、磷脂与胆固醇的比例、药脂比、超声时间、水化温度、DSPE-mPEG2000用量、不同pH值水化介质的选择、微射流压力对包封率的影响进行了单因素实验。实验结果表明,磷脂与胆固醇的比例、药脂比、超声时间对脂质体包封率的影响较大,而水化温度、DSPE-mPEG2000用量、不同pH值水化介质的选择、旋蒸温度对包封率的影响较小,因此选取影响较大的3个因素确定影响范围,通Box-Behnken响应面法的进行蟾酥提取物长循环纳米脂质体工艺优化。

本实验在单因素考察的基础上,选用薄膜分散微射流均质法制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体,以包封率为主要指标,通过星点设计-响应面法试验筛选出蟾酥提取物长循环纳米脂质体的最佳处方工艺和制备工艺。工艺验证结果表明:测得包封率和载药量较高,且粒径也符合肝靶向要求,说明采用此法制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体工艺稳定,科学合理。

 

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